25bp
DNA ladder
● 产品编号及规格：
RTM444
50次 (250 μl)
● 产品组成：
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货号
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名称
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规格
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RTM444-01
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25bp DNA ladder
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50次（250 μl）
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DL070-01
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6×Native-PAGE DNA上样缓冲液
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1 ml
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DL020-01
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6×DualColor DNA
loading buffer (双染料)
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1 ml
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● 产品简介：
本产品是由8条带状双链DNA条带组成的精准定量Marker，适用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中DNA条带大小和含量的分析。8条带的大小分别为25，50，100，150，200，300，400，500bp。其中200bp
bp条带为加亮带，含量为100ng/5μl，其余条带浓度为50ng/5μl。
本产品为双链DNA
Marker，适用于非变性的PAGE电泳和琼脂糖凝胶电泳，不适用于尿素PAGE电泳。由于片段较小，如使用琼脂糖分离，建议使用高分辨率琼脂糖凝胶电泳分离。
按照每次上样5
μl计算，该产品可以使用50次。
● 储存、效期及运输：
-20℃ 贮存;有效期3年；湿冰运输。
● 使用方法：
一、 TBE-PAGE凝胶分离：
1.1制备凝胶步骤：
1.1.1参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。
1.1.2按照表一将不同体积的成分在小烧杯或试管中混合；最后加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。
注：25bp DNA ladder适用于配制15%TBE-PAGE胶。
1.1.3在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液（对于mini-gel，凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5 cm或距梳齿约0.5 cm即可），然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1-2 cm的无水乙醇，使凝胶表面保持平整。
1.1.4静置10-20分钟，待分离胶和乙醇层之间出现一个清晰的界面后，说明凝胶已聚合
表一 TBE-PAGE分离胶配方表 (总体积5 ml，适用于1mm厚度小板胶)
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各组份体积（ml）
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最佳DNA分离范围
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凝胶浓度
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灭菌水
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30%PAA（29：1）
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5×TBE
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10%APS
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TEMED
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70-450 bp
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6%
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3
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1.0
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1.0
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0.05
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0.005
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60-460 bp
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8%
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2.66
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1.34
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1.0
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0.05
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0.005
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50-300 bp
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10%
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2.33
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1.67
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1.0
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0.05
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0.005
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40-200 bp
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12%
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2
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2.0
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1.0
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0.05
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0.005
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25-150 bp
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15%
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0.5
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2.5
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1.0
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0.05
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0.005
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5-100 bp
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20%
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0.66
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3.34
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1.0
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0.05
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0.005
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1.1.5去除覆盖在分离胶上的乙醇；按照表二将不同体积成分在一个小烧杯或试管中混合；最后加入10%过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。
表二 TBE-PAGE 4%浓缩配方表 (总体积1.5 ml，适用于1mm厚度小板胶)
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各组份体积（ml）
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凝胶浓度
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灭菌水
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30%PAA（29：1）
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5×TBE
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10%APS
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TEMED
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4%
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1.0
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0.2
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0.3
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0.02
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0.002
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1.1.6将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端；将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。
1.1.7静置30-60分钟，等待浓缩胶聚合。
注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。
1.2 电泳：
1.2.1 将凝胶板固定在电泳装置上，往上槽和下槽中加入1×TBE电泳液，1 ml吸头冲洗加样孔1-2次。
1.2.2 取待测样品，加入相应体积6×Native PAGE DNA上样缓冲液，如5 μl样品加1 μl 上样缓冲液，短暂离心后取5-10 μl上样。 25bp DNA
ladder已经含有上样缓冲液，1
mm厚10齿梳子直接上样5
μl，其余梳齿和厚度凝胶适量调整上样量。
1.2.3 连接电源线，打开电源开关。200 V稳压电泳。至二甲苯菁指示前沿到达距离凝胶下沿二分之一位置时结束电泳（~50bp），此时溴酚蓝指示前沿在凝胶下沿边界（~17bp）。
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PAGE凝胶浓度
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恒电压
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起始电流
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结束电流
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二甲苯菁
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溴酚蓝
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电泳时间
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15%
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200 V
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25-30
mA/板胶
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10-18 mA/板胶
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~50 bp
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~17 bp
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35+min
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1.3染色：
1.3.1 漂洗：玻璃板上拆下凝胶后，适量蒸馏水漂洗3-5分钟。
1.3.2 染色液配制：
TBE-PAGE胶可以使用RealSafe类染料后染染色，以下程序用RealSafe Red核酸染料（货号：GR002）进行染色。即用型染色液配制：
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即用型RealSafe核酸染色液
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配制量100 ml
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1×TBE
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100 ml
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RealSafe Red核酸染料
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10 μl
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1.3.3染色和观察：
凝胶浸泡于即用型染色液中，常温避光摇床40-60 rpm染色30 分钟。紫外光或蓝光仪下观察。
二、 琼脂糖凝胶分离：
2.1 琼脂糖凝胶制备：
由于片段较小，建议选用高分辨率琼脂糖（货号AR1036）制胶。以下步骤以制备50
ml 3%凝胶为例：
称取1.5
g琼脂糖于玻璃三角瓶中，加入50
ml 1×TAE，5 μl RealSafe Red核酸染料或其他核酸染料（如EB，GoldView），混匀，盖好瓶盖，微波炉中火加热至沸腾，轻摇混匀，重复1-2次至琼脂糖完全溶解，无可见颗粒。倒入制胶容器中，插好梳子，常温凝固30-50分钟至凝胶完全凝固。
2.2 电泳：
取待测样品，加入相应体积6×DualColor DNA loading buffer，如10 μl样品加2 μl 上样缓冲液，短暂离心后取5-10 μl上样。 25bp DNA
ladder 1 mm厚10齿梳子上样5 μl，其余梳齿和厚度凝胶适量调整上样量。
建议电泳条件：凝胶浓度为3％，电泳电压8-10
v/cm（单位电压指电泳槽阴阳极之间的距离电压，如阴极阳极之间的距离为20 cm，可以用160-200
V电压进行稳压电泳），待溴酚蓝指示前沿距离凝胶末端2 cm时终止电泳，电泳时间35-40分钟。
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琼脂糖浓度
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电泳缓冲液
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二甲苯菁
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溴酚蓝
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单位电压
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电泳时间
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3%
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1×TAE
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~1000 bp
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~100 bp
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8-10 V/cm
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40min+
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1×TBE
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~700 bp
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~60 bp
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8-10 V/cm
|
40min+
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2.3观察条带。
注：使用EB或Goldview染料时，由于染料本身带正电荷较多，随着电泳时间的延长，染料会向阴极聚集，导致小片段核酸结合的染料含量降低，会出现小片段的DNA片段紫外灯下亮度变弱或不可见。此时可以将胶浸泡于含有染料的电泳缓冲液中染色15-20分钟即可看到小片段。使用RealSafe类染料可以直接观察条带。
2.4 实验示例：
