1.4.4 4℃16,000g离心15分钟,去掉上清,保留沉淀。
1.5 细胞组蛋白提取:
1.5.1 沉淀重悬于0.25 ml 提取缓冲液中,超声处理(推荐130W功率超声2分钟,超声2秒,停顿3秒),冰浴30分钟,间歇混匀。
注:超声处理为必须步骤,否则沉淀很难彻底溶解,大大降低组蛋白提取得率。
1.5.2 4℃ 16000g 离心10分钟,收集组蛋白上清。
1.5.3 即用型中和缓冲液配制:
取适当体积的中和缓冲液,在使用前数分钟内加入1/100体积的PMSF(100×),1/40体积去乙酰化酶抑制剂和1/500体积
1M DTT,配成即用型中和缓冲液,随后立即放于冰上待用。
1.5.4 组蛋白上清中加入0.3倍体积即用型中和缓冲液,混匀,即为组蛋白提取溶液。
注:组蛋白溶液电泳检测时,如果加入上样缓冲液后溶液变黄,加入1/10体积中和缓冲液将颜色调整为蓝色后再上样。
1.6 组蛋白贮存:
组蛋白溶液-20℃贮存一周或-80℃长期贮存。
二 新鲜组织组蛋白提取:
2.1即用型裂解缓冲液配制:
常温融解试剂盒中的试剂,溶解后立即放置在冰上,混匀。取适当体积的裂解缓冲液,在使用前数分钟内加入1/100体积的PMSF(100×)和1/40体积去乙酰化酶抑制剂,配成即用型裂解缓冲液,随后立即放于冰上待用。
2.2准备组织:
组织块迅速置于预冷的1×PBS 中,漂洗数次,滤纸吸干水分,将组织切成细小的组织块,称重组织,按照下表加入各试剂的量
组织重量(mg)
|
即用型裂解缓冲液(μl)
第一次裂解
|
即用型裂解缓冲液(μl)
第二次裂解
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50
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1000
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500
|
注:50
mg新鲜组织相当于细胞沉淀体积(PCV,Packed Cell Volume)约为100 μl。
2.3 组织裂解:
2.3.1第一次裂解:组织中加入即用型裂解缓冲液(10倍PCV体积),用玻璃匀浆器冰浴匀浆10-20次,以彻底裂解细胞,收集裂解混合物,冰浴处理15分钟,间歇混匀。
2.3.2 第二次裂解:4℃ 600 g离心5
min收集细胞,尽最大努力吸尽上清,细胞沉淀中加入即用型裂解缓冲液(5倍PCV体积)。
2.3.3用超声破碎细胞(推荐130W功率超声1分钟,超声2秒,停顿3秒)或用玻璃匀浆
器冰浴匀浆5-10次或使用注射器用27G针头处理裂解物10-15次(货号:PE2719,蛋白提取针头套装),以彻底裂解细胞,收集裂解混合物,冰浴处理15分钟。
注:此步骤不要过度匀浆或超声处理,否则得到的组蛋白会污染较多的胞浆蛋白,可以用台盼蓝染色观察细胞裂解情况,建议70-80%细胞裂解为适宜裂解程度。加入裂解缓冲液后,细胞膜完全破裂,胞浆完全释放,但细胞核保持完整。镜检下可以看到完全染成蓝色的细胞核。
2.3.4 16,000g 4℃离心15分钟,去掉上清,保留沉淀。
2.4 组织组蛋白提取:
2.4.1 沉淀重悬于0.25 ml 提取缓冲液中,超声处理(推荐130W功率超声2分钟,超声2秒,停顿3秒),冰浴30分钟,间歇混匀。
注:超声处理为必须步骤,否则沉淀很难彻底溶解,大大降低组蛋白提取得率。
2.4.2 4℃16000g 离心10分钟,收集组蛋白上清。
2.4.3 即用型中和缓冲液配制:
取适当体积的中和缓冲液,在使用前数分钟内加入1/100体积的PMSF(100×),1/40体积去乙酰化酶抑制剂和1/500体积
1M DTT,配成即用型中和缓冲液,随后立即放于冰上待用。
2.4.4 组蛋白上清中加入0.3倍体积即用型中和缓冲液,混匀,即为组蛋白提取溶液。
注:组蛋白溶液电泳检测时,如果加入上样缓冲液后溶液变黄,加入1/10体积中和缓冲液将颜色调整为蓝色后再上样。
2.5 组蛋白贮存:
组蛋白溶液-20℃贮存一周或-80℃长期贮存。