植物总蛋白提取试剂盒-通用型
Plant Total Protein Isolation Kit（for general use）
● 产品货号及规格
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产品编号
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名称
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规格
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贮存
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RTD8103-01
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试剂A-样本杂质去除剂
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20 ml
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4℃
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RTD8103-02
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试剂B-植物蛋白提取缓冲液II
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15 ml
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4℃
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RTD8103-03
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试剂C-蛋白纯化剂
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15 ml
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4℃ 避光
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RTD8103-04
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试剂D-漂洗缓冲液
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10 ml
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-20℃
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RTD8103-05
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溶液E-蛋白沉淀剂
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40 ml
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常温(配制后4℃)
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DT0140P-01
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1M DTT
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1 ml
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4℃ (配制后-20℃)
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PC2030-03
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蛋白酶抑制剂混合物（100×,植物样品用）
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0.2 ml
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-20℃
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PL080-01
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5×MonoClolor 蛋白上样缓冲液(变性，还原)
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1 ml
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-20℃
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● 产品简介
本产品能够有效裂解各种植物器官（如叶片，根，茎，果实，种子，花），去除各种植物样品（包括富含次生代谢物质和多糖多酚的植物）中常见的污染，如多糖，多酚，脂类，色素，次生代谢物等，得到的高纯度蛋白样品，可以用于SDS-PAGE凝胶电泳，Western印迹分析以及双向电泳（2D电泳）。
该试剂盒含有除丙酮外的其他所有试剂，使用方便，能在3小时内得到高纯度的蛋白样品。
按照每次提取使用0.7ml试剂B计算，该试剂盒可以至少使用20次。
● 使用方法：
实验准备材料：
液氮；研钵；1.5ml离心管；一次性注射器；丙酮；80%丙酮；70℃水浴锅；干浴器；冷冻离心机；制冰机；涡旋振荡器。
一. 样品破碎：
1.1
取植物样本，在液氮条件下，用研钵充分研磨成粉末。
关键步骤：此步骤非常重要，样本研磨越细越好，研磨不彻底会导致蛋白浓度偏低。
二. 沉淀杂质：
2.1
取1.5 ml离心管，加入1
ml即用型试剂A（按照下表配制），迅速将约0.1克粉末加入其中，漩涡混匀，RT
放置5分钟。
关键步骤：样品粉末量不能超过0.1克，否则将导致蛋白提取得率和纯度大大降低。
即用型试剂A-样本杂质去除剂配制
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即用型试剂A
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1个样品
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2个样品
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n个样品
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试剂A-样本杂质去除剂
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0.5 ml
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1 ml
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n×0.5
ml
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丙酮
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0.5 ml
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1 ml
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n×0.5
ml
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1M
DTT
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10 μl
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20 μl
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n×10
μl
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2.212000g4℃离心5分钟，去除上清，保留沉淀。
注：观察沉淀颜色，如沉淀颜色为绿色，继续步骤2.3；如沉淀颜色为浅色或白色，直接进行步骤2.4。
2.3
沉淀中加入1 ml即用型试剂A，漩涡混匀，RT放置5分钟，12000g4℃离心5分钟。
2.4
沉淀中加入1 ml 预冷的丙酮（自备，试剂盒不提供）和10
μl DTT溶液，漩涡震荡（此时溶液状态应为白色悬液），彻底重悬，12000g4℃离心5分钟，去除上清，收集沉淀。
2.5
快甩离心数秒，残留上清用移液器彻底吸弃，沉淀物通风晾干1-2分钟至沉淀干燥。
关键步骤：沉淀不能过分干燥，否则会影响以下步骤蛋白的溶解性。
三. 蛋白粗提：
3.1
蛋白沉淀中加入0.7 ml 即用型试剂B（按照下表配制），漩涡震荡，彻底重悬沉淀（此时溶液状态为淡蓝色的悬浮溶液）；70℃水浴1小时，间歇混匀。
即用型试剂B-植物蛋白提取缓冲液配制：
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即用型试剂B
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试剂B-植物蛋白提取缓冲液II
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0.7 ml
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5 ml
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10 ml
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蛋白酶抑制剂混合物（100×）
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7 μl
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50 μl
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100 μl
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1M
DTT
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7 μl
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50 μl
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100 μl
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3.212000g4℃离心10分钟，小心取上清（通常可取600
μl，溶液为淡蓝色）于1.5ml离心管中，不要吸取沉淀。
注：此步骤得到的蛋白溶液可以进行大多数蛋白实验，如WB。如要进行双向电泳（2D电泳）实验，继续以下步骤。
四. 蛋白纯化：
4.1
加入与上清等体积的试剂C（注：试剂C上层为保护相，应该吸取下部的淡黄色液体），剧烈颠倒震荡后常温放置1-2分钟，12000gRT 离心5分钟，溶液分成两层，上层溶液为蓝色，蛋白位于下层溶液中。
注：试剂C有腐蚀性，请在通风橱内操作，注意防护。
4.2
用一次性注射器小心吸取下层溶液（通常可取350 μl）于1.5
ml离心管中，加入等体积试剂D，剧烈颠倒混匀，12000gRT 离心5分钟，蛋白位于上层溶液中，收集上层溶液（通常可取150-200
μl）于1.5ml离心管中。
五. 蛋白沉淀：
5.1
蛋白溶液中加入5倍体积溶液E（注意是否已经按照标签所示加入甲醇），颠倒混匀，此时可见有絮状沉淀生产，-20℃ 沉淀30分钟。
注：微量蛋白的提取可以-20℃过夜沉淀。
5.212000g4℃离心10分钟，收集蛋白沉淀，去除上清。
注：正常的蛋白沉淀接近无色，如颜色为褐色或淡黄色说明蛋白不纯，不能用于双向电泳实验。重复步骤3.1-5.2，直至蛋白沉淀接近无色。
5.3
沉淀中加入1ml 溶液E（注意是否已经按照标签所示加入甲醇），彻底重悬沉淀，12000rpm4℃离心5分钟，弃上清。
5.4
沉淀中加入1ml预冷的80%丙酮（自备，试剂盒不提供）和10
μl DTT，彻底重悬沉淀，12000g4℃离心5分钟，弃上清。
5.5
快甩离心数秒，残留上清移液器彻底吸弃，沉淀物通风晾干1-2分钟至沉淀干燥。
关键步骤：沉淀不能过分干燥，否则不好溶解。
六. 蛋白溶解：
6.1
沉淀中溶解于适量PBS溶液或者适当体积样品缓冲液溶解，-20℃或-80℃贮存。
注：① 如进行双向电泳，样品溶于双向电泳样品缓冲液中；如进行单向电泳，样品溶于1×SDS-PAGE 上样缓冲液中。
② 由于提取过程中使用了DTT，为了避免DTT对蛋白浓度测定的干扰，蛋白定量时尽量选择Bradford方法。